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环孢素A对斑点叉尾鮰疱疹病毒增殖的影响

  斑点叉尾鮰(Ietalurus Punetaus)是从国外引进的一种重要的特种水产养殖鱼类,深受消费者青睐。但随着养殖规模的不断扩大和集约化程度日益提高,养殖环境恶化,斑点叉尾鮰病害日趋严重,其中由斑点叉尾鮰疱疹病毒(channel catfish virus,CCV)引发的斑点叉尾鮰疱疹病毒病(channel catfish virus disease, CCVD)危害最大。CCVD的暴发造成鱼苗、鱼种的死亡率高达90%以上,且无有效的治疗方法,给斑点叉尾鮰的养殖生产造成了巨大的经济损失。大量研究表明,环孢素A(CsA)对多种病毒的增殖具有抑制作用,而关于CsA对CCV的作用尚未见报道。本研究通过体外实验研究CsA对CCV增殖的影响,以期为防治斑点叉尾鮰疱疹病毒病提供重要的实验依据和参考资料。


  1 材料与方法


  1.1 细胞与培养


  斑点叉尾鮰卵巢细胞系(channel catfish ovary cell,CCO)由华中农业大学水产学院提供。CCO细胞用含10% FBS的DMEM培养基在280C含5% CO2的培养箱中培养。通常2~3d传代1次,将细胞用PBS洗1次,在每个T25培养瓶中加入1ml的胰酶消化1min左右,随后再将胰酶除去,最后再添加含有10% FBS的DMEM培养基15毫升,将细胞吹散,摇匀分到3个T25培养瓶中培养。


  1.2 病毒与感染


  CCV病毒由华中农业大学水产学院提供。待CCO细胞生长状态良好时,以适当比例传代于大瓶中培养,24h内进行CCV的感染,首先吸去瓶中的细胞培养液,然后将细胞用无胎牛血清的DMEM细胞培养液清洗一遍,随后吸去没有用的废液,然后向细胞内加入稀释过107倍的CCV悬液0.5毫升,使液体覆盖细胞培养面,280C孵育1h,期间每隔20min轻摇晃一次使液体完全覆盖细胞培养面,之后吸弃CCV悬液,加入含5%胎牛血清的DMEM培养基,置于28℃培养、增殖,随后在显微镜下观察,当细胞完全病变后就放入-800C下保存。


  1.3 抑制剂(CSA)的配制及其细胞毒性检测


  将CSA粉末溶入DMSO中配制成不同的浓度分开装好后置于-200C冰箱中保存。在96孔板上接种CPB细胞,当细胞长到单层时,更换含有不同浓度CsA的培养液(0、2.5、5、10 、20、40μmol/L),在培养12h、24h、36h、48h和72h后用MTS法分别检测其细胞活性。


  1.4  CSA对CCV病毒增殖的影响


  在24孔细胞培养板上接种CCO,当细胞生长至55%左右融合时,就开始加入含不同浓度CSA培养基,同时设立DMSO为对照组,CsA作用12h后接种1 MOI 的CCV,吸附完成后换入含不同浓度CsA的培养基,CCV感染后72h收取样品。用TCID50法检测病毒滴度。


  1.5  CsA对CCV诱导的细胞因子表达的影响


  将CCO细胞接种于6孔细胞培养板中,等细胞长到50%~60%融合时,换入含有CsA的细胞培养液,同时设立DMSO为对照组。CsA作用12h后接种1 MOI 的CCV。另设一组接种无血清的DMEM培养基,作为正常细胞对照组。感染后12h、24h、36h和48h收取样品,加入TRizol试剂裂解,置于-80℃保存备用。


  1.6 实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR)


  使用TRIzol试剂盒提取总RNA,按说明书进行。反转录使用PrimescriptR RT reagent Kit  With gDNA Eraser试剂盒,每个样品使用1μg总RNA进行反转录。使用SYBR染料法(Takara的SYBR Premix Ex Taq试剂盒)进行相对定量PCR,以斑点叉尾鮰的18s rRNA作为内参,用△△CT法计算,以全培养基组作为100%。使用ABI 7,500荧光定量PCR仪,反应条件为:首先95℃ 30s进行预变性;随后进行40个循环,反应为95℃ 5s,60℃ 34s。扩增反应完成后,进行溶解曲线分析,以确定引物的特异性。实验所用引物见表1。


  表1   qRT-PCR引物



  2  结果与分析


  2.1不同浓度CSA对CCO细胞毒性检测


  从图1中可以看出,当CsA的浓度小于等于10μmol/L的时候,在各个时间点对CCO细胞的活力均无显著影响。因此,后续研究中使用CsA的最大浓度为10μmol/L。



  图1 MTS法检测CsA对CCO细胞的毒性


  2.2  CSA对CCV病毒增殖的影响


  从图2中可以看出,CsA浓度在0到10μmol/L之间,随着细胞中添加的CSA浓度的增加,细胞被病毒感染的感染率在不停降低,说明CsA对CCV的增殖起着抑制作用。



  图2 不同浓度CsA对CCV增殖的影响


  2.3  CsA对CCV诱导的细胞因子表达的影响


  CCV的感染会诱导宿主的先天性免疫反应,导致宿主的一些细胞因子的表达发生变化,为研究CsA 对CCV感染后的细胞因子表达的影响,于感染后的6h、12h、24h、36h、48h和72h分别收样,用qRT-PCR方法检测CPB细胞中细胞因子的变化。结果表明,CsA对CCV感染后诱导的IL-8和TNF-α的表达均有抑制作用(图3,图4)。



  图3 CsA对CCV感染后细胞中IL-8表达的影响



  图4  CsA对CCV感染后细胞中TNF-α表达的影响


  3  讨论


  环孢素A(CsA),是一种使用广泛、作用强效的免疫抑制剂,可以特异和可逆地作用于淋巴细胞,抑制淋巴细胞的激活和增殖,抑制某些细胞相关的炎症因子的产生和释放,从而起到抑制细胞免疫的作用。CsA是由11个氨基酸组成的多肽。CsA进入细胞后先与CypA形成复合物(CypA-CsA),再与钙调磷酸酶(calcineurin,CN)结合,抑制CN酶活性,从而使其底物—激活的T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NF-AT)不能去磷酸化,抑制了NF-AT从胞浆进入细胞核内形成转录复合体,进一步抑制IL-2、IL-4、γ-干扰素等细胞因子的转录。CsA通过在转录水平上通过阻断T细胞的活化,从而实现免疫抑制效果。


  关于CsA对病毒增殖的抑制作用已有很多的研究报道。Kim等对猪流行性腹泻病毒(PEDV)研究发现,CsA能抑制PEDV诱导的细胞凋亡,进而抑制PEDV的增殖。CsA 对多种冠状病毒的增殖都有抑制作用。CsA通过调节干扰素途径的关键因子的表达,促进I型干扰素的先天性免疫功能,从而抑制轮状病毒的复制。在对甲型流感病毒和丙型肝炎病毒等研究中,也有类似的结果[10,11]。胡先勤等研究表明,CsA可以显著抑制鳜鱼虹彩病毒(ISKNV)的增殖。本文的研究结果表明,CsA也能显著抑制CCV的增殖,有关于其作用机理需要进行进一步研究。


  病毒感染会诱导细胞产生炎症反应,本文研究结果表明,CsA对CCV感染后诱导的IL-8和TNF-α的表达有抑制作用。提示CsA对CCV感染诱导的细胞因子的表达具有调节作用,可能在相关信号通路中发挥重要作用,有关其具体机制需要进一步研究。


  由于CsA对CCV的增殖具有显著的抑制作用,由此推测CsA及其衍生物将来可以作为防治CCV的候选药物。


  (参考文献略)


  【基金项目:武汉轻工大学大学生科研项目(xsky2016026);武汉轻工大学引进人才科研启动项目(2016RZ10)】


  END


  1、来源: 腾氏水产商务网-当代水产杂志社


  2、作者: 武汉轻工大学 动物营养与饲料科学湖北省重点实验室 周阳 胡先勤 周建军 彭银苏 王超 罗一帆 陈潜双


  3、腾氏水产商务网微信号:tsfish  


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