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3种气单胞菌耐药性及致病性的研究进展


  作者:吉林农业大学动物科学技术学院水产实验室 焦雪 冷东泽 王建超 巴翠玉 李月红


  内蒙古乌兰察布市农牧综合行政执法大队 安俊花


  内蒙古乌兰察布市水产站 张翔宇


  吉林省卫生监测检测中心张培军


  气单胞菌广泛分布于水生生态系统中,不仅存在淡水流域的河流、沿海等地,还存在于自来水中,隶属革兰阴性菌,既可以感染鱼类,也可以感染人畜,是一种人-鱼-兽共患的条件性致病菌。本文着重以鱼类感染嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌所表现的临床症状为例,重点对这3种气单胞菌的形态特征及抗生素的耐药性、致病性进行讨论,以期为气单胞菌属的预防、治疗提供有利的参考和科学依据。


  1 菌属定义及形态特征


  1.1 嗜水气单胞菌


  1890年,Zimmermann从饮用水中分离该菌;1891年,Sanarelli从受感染的青蛙中分离得到此菌;1901年,该菌正式被Chester修改为嗜水杆菌。其菌两端钝圆、无芽孢、不产生荚膜;大小为0.3~1.0μm×1.0~3.5μm。它为该属的模式种:ATCC7966(DSM30187、NCDC359-60、NCTC8049),该菌DNA中G+Cmol%为57~63(Tm)


  1.2 温和气单胞菌


  该菌于1987年在美国马里兰州自野生产卵的湖鰶中分离得到(在B.Austin等著的Bacterial FishPathogens:Disease of Farmed and Wild Fish’第3版中记述)。菌体呈短杆状,以极端单鞭毛运动,两端钝圆,直径0.3~1.0μm,长度1.0~3.5μm。其DNA中的G+Cmol%为58~60(Tm),模式株:ATCC43979(CIP7433),它易与嗜水气单胞菌混淆,二者区别是嗜水气单胞菌可分解七叶苷和水杨苷而温和气单胞菌不能。


  1.3 维氏气单胞菌


  又叫维罗纳气单胞菌、凡隆气单胞菌、维隆气单胞菌。其形态特征是杆状、散在、两端钝圆、无芽孢、大小在0.3~0.7μm×1.2~2.5μm(个别菌体长丝状)。模式菌株为ATCC35604(CDC1169-83)。它有两个变种:维氏气单胞菌温和生物型,G+C含量为58.6%;维罗纳生物型,G+C含量为59.6%(Tm)。


  2 抗生素的耐药性


  2.1 β-内酰胺类


  宋铁英等40株嗜水气单胞菌进行耐药性检测结果发现,菌株大多对青霉素耐药;阎斌伦通过琼脂扩散法对3株维氏气单胞菌进行药敏检测,结果显示,菌株对青霉素、氨苄青霉素均耐药。产生耐药的原因很可能因为青霉素作用机制是破坏细胞壁中的黏肽,而革兰阴性菌细胞壁中黏肽较少,所以不敏感,而近年来频繁使用青霉素类药物作为治疗革兰阴性菌的首选药物导致对其产生不敏感性从而使其耐药。


  2.2喹诺酮类


  张路等采用菌落计数法测定维氏气单胞菌对加替沙星、盐酸环丙沙星、盐酸左氧氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星5种喹诺酮类抗生素后效应(PAE)值,结果表明,产生PAE最长的药物为盐酸左氧氟沙星,最短的药物为诺氟沙星,且5种喹诺酮类药物产生的PAE与药物浓度具有明显的依赖性,说明延长PAE后能提高减少喂药次数、经济效益,达到治疗择优的效果;方一风等从浙、苏、皖等地水产动物中分离23株致病性嗜水气单胞菌并根据美国临床实验室标准化协会药敏判断标准(2011版)测定并筛选喹诺酮类耐药株,结果表明,所有菌株都存在5种以上药物的耐药性,其中55.6%对恩诺沙星耐药并携带qnrS耐药基因;谭爱萍采用K-B纸片法测定了67株气单胞菌对常用抗生素的耐药性,结果表明,气单胞菌对喹诺酮类药物呈现中等耐药,耐药率介于19.40%~64.18%,其中19.40%(13/67)的菌株携带喹诺酮类耐药(PMQR)基因,8.96%(6/67)携带qnrS1基因、5.97%(4/67)携带qnrS2基因、7.47%(5/67)携带aac(6’)-Ib-cr基因,13株PMQR基因阳性菌株均分别携带1~4个质粒。通过研究发现,大多数气单胞菌对多种抗菌药物存在多重耐药现象,而且PMQR机制的存在预示着喹诺酮类耐药性很可能会在水产临床上更加快速而广泛地传播,应引起重视。


  2.3 氨基糖苷类


  宋铁英等对40株嗜水气单胞菌进行耐药性检测结果显示,分别有22株和21株对链霉素和卡那霉素耐药;有19株对丁胺卡那霉素中度敏感;5株全部耐药;9株对庆大霉素中度敏感;6株全部耐药。曲芬从19株分离自肝病患者及腹泻患者的耐药气单胞菌中检测到4种氨基苷修饰酶(aac(3)2-I、aac(3)2-II、aac(6’)2-I和ant(3”)2-I)基因,王海娟在7株维氏气单胞菌中检测出耐药基因aac(6’)-Ib和aac(3)-IIa,并表明aac(6’)-Ib和aac(3)-IIa的存在是导致鱼源维氏气单胞菌分离株对氨基糖苷类耐药的主要原因。因此,在疾病防治中要合理用药,不定期更换抗生素的使用类型,避免长期使用氨基糖苷类单一药物使细菌在选择压力下产生耐药性。


  2.4 四环素类


  王美珍对3株嗜水气单胞菌的MIC值测定结果表明,菌株对四环素类药物存在交叉耐药现象。赵敏从四川地区42株维氏气单胞菌中检测到tetC、tetE、tetA、tetB、floR和qnrS基因,并在8株维氏气单胞菌中同时检测到ParC第87位和GyrA第83位氨基酸由Ser突变为Ile;耐药菌株质粒中存在qnrS和tetA基因。


  2.5 磺胺类药物


  在泰国、巴基斯坦等养鱼场中与I型整合子相关的Sul2基因普遍存在,说明携带Sul2基因是鱼源分离菌株对磺胺类药物耐药的主要因素。耿昕颖通过对52株维氏气单胞菌进行微量肉汤稀释法检测,其中磺胺间甲氧嘧啶的耐药率达到94.23%;Nawaz利用多重PCR方法从鲶鱼维氏气单胞菌中检测到四环素耐药基因tetA和tetB基因,Alois从鲤鱼和锦鲤共获得气单胞菌121株,利用PCR方法对tet(A-E)基因、整合子基因和基因盒进行检测,结果表明,在48株菌株中检测出tet(A-E)基因,其中tetE占主要地位,在17株菌株中检测出intl1基因,检测出在I类整合子可变区含有4种基因盒。


  3 致病性和致病因子


  气单胞菌最初并没有引起研究者们及临床学家注意的原因是该菌虽在自然界中广泛分布,但它的毒力较低、不易辨别,而且在一般情况下不易致病。但近几年,世界各地从多种临床标本中分离到纯培养状态的气单胞菌并发现了一些特殊的毒力因子。其中嗜温有动力气单胞菌属与鱼类疾病息息相关。由于该菌也能引起人类、牲畜患病,因此也是人-鱼-兽共患的条件性病原菌。气单胞菌属引起的细菌侵染,不仅影响了水产养殖业的经济基础,它还可通过水产品和水生动物感染人畜,轻者导致人畜腹泻,重者食物中毒甚至是败血症,严重影响人类以及牲畜健康。因此,气单胞菌作为一种严重的致病菌,已引起水产界、医学界和兽医学界的高度重视。


  3.1 致病性


  充血、出血;内脏器官肝、脾及肠道出现不同程度糜烂并伴有腹水。维氏气单胞菌引起的败血症主要症状为病鱼体表大面积出血,鳃丝泛白,肛门红肿,腹腔有大量腹水,肝、脾、肾肿大,部分病鱼肠道内有黄色


  黏液。温和气单胞菌所引起的败血症症状与两者类似,有的是由于体质较弱、导致病原菌侵入数量增多、毒力增强所致;病情严重的一些病鱼会出现厌食,静止不动或发生阵发性乱游,最后体衰而亡。


  3.2致病因子


  导致嗜水气单胞菌致病性的原因主要是由于毒力基因的表达,毒力基因又包括外毒素(Extracellartoxin)、S层蛋白(S-Lsyer)、胞外蛋白酶(Extracellar)、外膜蛋白(OMP)、菌毛(Pili)、鞭毛蛋白、脂肪酶、蛋白酶等。而毒力基因的表达又是由多种致病因子相互作用。包括粘附、侵袭、体内增殖及产生毒素等一系列复杂的生理过程,Carrello在研究菌毛及外膜蛋白时发现,嗜水气单胞菌的菌毛分为两类,一类短而硬,与细菌的自凝作用有关,称为S菌毛;另一类长而软,与细菌的粘附作用及血凝作用有关,称为L菌毛,它们能与宿主细胞膜受体中的糖残基发生反应,从而使细菌固着在宿主细胞上。故免疫功能正常的人也有可能被感染嗜水气单胞菌,人感染嗜水气单胞菌胃肠炎通常表现在3个方面;急性型,水样腹泻、痢疾样黏液和血性腹泻、慢性腹泻。哺乳动物如牛等感染嗜水气单胞菌严重时以脾、肝和肾的危害最为严重。肾的病变以肾小球严重肿大和肾小管上皮细胞坏死为特征;脾主要表现为急性败血型,红髓充血、出血严重,白髓几乎完全消失;肝呈现弥漫性坏死,组织结构被破坏。


  温和气单胞菌致病株主要与溶血素、肠毒素、细胞毒素及胞外酶等多种重要致病因子有关。当条件适宜时,该菌生长迅速,繁殖较快,其产生的毒素可引起机体复杂多样的病理变化。国内外学者通过对病人临床资料分析发现,同时存在3种毒力基因的温和气单胞菌的分离株可导致人类腹泻和水产动物败血性疾病,单一毒力基因阳性的分离株的致病性较弱。并且发现在不同表型种及不同来源的菌株间,毒力基因种类存在一定差异。2009-2010年5月,在中国医学科学院血液学研究所血液病医院发现2例温和气单胞菌败血症伴下肢蜂窝织炎死亡,其临床表现是均突发畏寒、寒战,体温最高达39℃~41℃,表现为反复高热,伴发双下肢蜂窝织炎,病情进展迅速并出现感染性休克,随后治疗无效死亡;2015年4月,中国水产养殖网报道,广东省珠海市斗门区白蕉镇灯尖吻鲈冬棚养殖池塘在春节前后尖吻鲈相继死亡,且水温在25℃时死亡率增高,经16SrDNA测序鉴定为为温和气单胞菌。可见温和气单胞菌的毒力之强,故个人应提倡洁净饮食意识;渔民应提倡定期消毒、预防为主的意识,这样才能从根本上杜绝此菌的广泛传播。


  维氏气单胞菌菌株是微生态环境中正常存在的,但维氏气单胞菌其中的一部分则具有致病并侵染变温动物,并且维氏气单胞菌具有Ó型分泌系统使毒素增多、细菌毒力增强。故患维氏气单胞菌疾病的几率也比往年增多,引起研究者们广泛关注,它能产生磷脂酶、丝氨酸蛋白酶、核酸酶和弹性蛋白酶等毒力因子,而且它所携带的气溶素(aerolysin)、肠毒素(enterotoxin)和粘附因子(adherencefactor)等可引起水产动物、人类甚至畜禽患严重的疾病,但不是所有菌株都产生这些毒力因子,其来源不同,毒力因子也不同。虽然在温和气单胞菌和维氏气单胞菌毒力因子方面的研究还不如嗜水气单胞菌比较明确,但随着研究的不断深入,对温和气单胞菌和维氏气单胞菌毒力基因和致病机制的研究一定会越来越明确。


  4 小结


  由气单胞菌所引起的感染在感染性疾病中已居显著位置且对免疫力低下的鱼类影响明显。它的广泛分布,不仅对水产养殖业的发展构成了严重的威胁,还时时刻刻危害人畜的健康。近几年,有关气单胞菌的研究报道越来越多,已是水质监测中不能忽略的环节之一。本文着重从气单胞菌的形态特征、对抗生素的耐药性及致病性进行讨论,为气单胞菌属的预防,提高临床和实验室研究者对气单胞菌感染的认识以及诊治提供科学参考,也对气单胞菌以后的研究提供理论依据。同时,如何对气单胞菌更好的检测、预防和治疗也是今后所要研究的重点。


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